الوراثة العكسية

الوراثة العكسية هي طريقة في الوراثة الجزيئية تُستخدم للمساعدة في فهم وظيفة الجينات من خلال تحليل النمط الظاهري لتأثيرات محددة من تسلسل حمض نووي بعدها تكوين الهندسة الوراثية. عادةً ما تستمر العملية في الاتجاه المعاكس لما يسمى بالمقابل وراثة إالأمامية من علم الوراثة الكلاسيكية. بمعنى آخر ، في حين تسعى الوراثة الأمامية إلى إيجاد الأساس الوراثي لـ النمط الظاهري أو السمة ، فإن الوراثة العكسية تسعى إلى العثور على الأنواع الظاهرية الناشئة نتيجة لتسلسلات وراثية معينة.

رسم تخطيطي يوضح عملية تطوير لقاح أنفلونزا الطيور عن طريق تقنيات الوراثة العكسية

يُنتج تسلسل الحمض النووي كميات كبيرة من تسلسل بيانات الجينوم بسرعة نسبية. يتم اكتشاف العديد من التتابعات الوراثية قبل المعلومات البيولوجية الأخرى التي لا يمكن الحصول عليها بسهولة. تحاول الوراثة العكسية ربط تسلسل جيني معين بتأثيرات محددة على الكائن الحي.^{[بحاجة لمصدر]}

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

التقنيات المستخدمة

من أجل معرفة التأثير الذي يحدثه التسلسل على النمط الظاهري ، أو لاكتشاف وظيفته البيولوجية ، يمكن للباحثين إجراء هندسة لتغيير أو تعطيل DNA. بعد إجراء هذا التغيير ، يمكن للباحث أن يبحث عن تأثير هذه التعديلات في كامل الكائن الحي. هناك عدة طرق مختلفة لعلم الوراثة العكسية:

الحذوفات و مراحل الطفرات الموجهة

الطفرات الموجهة من الموقع هي تقنية متطورة يمكنها إما تغيير المناطق التنظيمية في المنشط من الجين أو إجراء تغييرات كودون خفية في إطار القراءة المفتوحة لتحديد المخلفات الأمينية المهمة لوظيفة البروتين.

النوع البري Physcomitrella patens (A) و Knockout moss es (B-D): الانحراف النمط الظاهري المستحث في محولات مكتبة تعطيل الجينات. نمت النباتات البرية المحولة من نباتات "فيزيتريلا" على وسيط Knop كحد أدنى للحث على تمييز وتطور gametophore. لكل مصنع ، يتم عرض نظرة عامة (الصف العلوي ؛ شريط النطاق يتوافق مع 1 مم) ويتم عرض لقطة قريبة (الصف السفلي ؛ شريط النطاق يساوي 0.5 مم). ج: نبات الطحلب البري من نوع Haploid مغطى بالكامل بأشجار المورقة المقربة وأوراق الشجر البرية. ب –د: الطفرات المختلفة.^[1]

بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لإنشاء ألّيلات فارغة بحيث لا يعمل الجين. على سبيل المثال ، يمكن إجراء حذف الجين بواسطة استهداف الجينات (خروج الجينات) في بعض الكائنات الحية ، مثل الخميرة ، الفئران و الطحالب. فريدة من نوعها بين النباتات ، في أطباق فيسكوميتريلا، فإن خروج الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل لإنشاء طحالب محذوف منها (انظر الشكل) يكون فعالًا تقريبًا كما هو الحال في الخميرة.^[2] في حالة نظام نموذج الخميرة ، تم إنشاء عمليات حذف موجهة في كل جين غير ضروري في جينوم الخميرة.^[3] في حالة تأسيس نموذج النظام ، تم إنشاء مكتبات متحولة ضخمة استنادًا إلى بنيات تعطيل الجينات.^[4] في عملية إدخال الجين ، يتم استبدال exon الداخلي بتسلسل متغير الفائدة.^[5]

في بعض الحالات ، يمكن استخدام الأليلات الشرطية بحيث يكون للجين وظيفة طبيعية حتى يتم تنشيط الأليل الشرطي. قد يستلزم هذا "طرق" في إعادة التشكيل للمواقع (مثل مواقع lox أو frt) التي ستتسبب في حذف الجين موضع الاهتمام عندما تكون إعادة التشكيل معينة (مثل CRE ، FLP) الناجم عنها. يمكن أن تتسبب إعادة التشكيل أو Flp في العلاجات الكيميائية أو معالجات الصدمات الحرارية أو تقتصر على مجموعة فرعية معينة من الأنسجة.

هناك تقنية أخرى يمكن استخدامها وهي TILLING. هذه طريقة تجمع بين تقنية قياسية وفعالة للطفرات مع طفرات كيميائية مثل إيتيل ميثانسولفنيت (EMS) Ethyl methanesulfonate مع تقنية حساسة لفحص الحمض النووي تحدد طفرات المرحلة في الجين المستهدف .

شلل الجينات

إن اكتشاف عملية إشلل الجينات باستخدام الحمض النووي الريبي المزدوج المحصور ، والمعروف أيضًا باسم تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، وتطوير ضربة قاضية لخروج الجينات باستخدام مورفولينو oligos ، جعل تعبير التعطيل الجيني وسيلة سهلة للوصول إلى العديد من الباحثين. يشار إلى هذه الطريقة غالبًا باسم ضربة قاضية لخروج الجينات نظرًا لأن تأثيرات هذه الكواشف مؤقتة عمومًا ، على النقيض من طرق خروج الجينات الدائمة.

يخلق RNAi تأثير ضربة قاضية محددة دون تحوير الحمض النووي موضع الاهتمام أو ذو فائدة . في C. إليگانس ، فاستخدم RNAi للتدخل المنهجي في التعبير عن معظم الجينات في الجينوم. حيث يعمل RNAi عن طريق توجيه الأنظمة الخلوية لتخفيض الحمض النووي الريبي للمرسال المستهدف (mRNA).

أصبح تداخل RNA ، وتحديداً شلل الجينات ، أداة مفيدة للشلل التعبير عن الجينات وتحديد وتحليل النمط الظاهري لفقدان الوظيفة. عندما تحدث طفرات في الأليلات ، فإن الوظيفة التي تمثلها وترمزها هي أيضًا طفرة وفقدان ؛ وهذا ما يسمى عموما طفرة فقدان الوظيفة.^[6] تتيح القدرة على تحليل النمط الظاهري لفقدان الوظيفة تحليل وظيفة الجين عندما لا يكون هناك وصول إلى أليلات متحولة.^[7]

في حين أن تدخل الحمض النووي الريبي يعتمد على المكونات الخلوية من أجل الفعالية (مثل بروتينات دايسر ، ومجمع RISC) يعد البديل البسيط لضربة قاضية للجينات هو Morpholino oligos antisense. يربط المورفولينوس ويمنع الوصول إلى الرنا المرسال المستهدف دون الحاجة إلى نشاط البروتينات الخلوية ودون تسريع انحلال الرنا المرسال بالضرورة. المورفولينوس فعال في الأنظمة التي تتراوح في التعقيد من الترجمة الخالية من الخلايا في أنبوب اختبار إلى دراسات في الجسم الحي في نماذج حيوانية كبيرة.

التدخل باستخدام الجينات المحورة

امنهج الوراثة الجزيئية هو إنشاء كائنات حية معدلة وراثيا overexpress لجينة طبيعيةذات فائدة . قد يعكس النمط الظاهري الناتج الوظيفة الطبيعية للجين.

بدلاً من ذلك ، من الممكن التعبير عن أشكال متحولة من الجين التي تتداخل مع وظيفة الجين ([النوع البري | النوع البري]]). على سبيل المثال ، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن جين متحور إلى ارتفاع مستويات البروتين غير الوظيفي مما يؤدي إلى تفاعل سلبية الغالبة مع بروتين النمط البري. في هذه الحالة ، سوف تتنافس النسخة المتحولة مع شركاء بروتينات النمط البري مما يؤدي إلى ظهور النمط الظاهري للطفرات.

يمكن أن تؤدي الأشكال الطافرة الأخرى إلى بروتين منظم بشكل غير طبيعي ونشط بشكل أساسي ("على" طوال الوقت). قد يكون هذا بسبب إزالة مجال تنظيمي أو تحور بقايا أمينية معينة يتم تعديلها بشكل عكسي (بواسطة الفسفرة ، مثيّلة ، أو يوبيكويتين). يعد التغيير أمرًا مهمًا لتعديل وظيفة البروتين وغالبًا ما يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرية مفيدة.

تركيب اللقاح

تلعب الوراثة العكسية دورًا كبيرًا في تركيب لقاح. يمكن إنشاء اللقاحات عن طريق هندسة أنماط وراثية جديدة من السلالات الفيروسية المعدية التي تقلل من فعاليتها المسببة للأمراض بما يكفي لتسهيل المناعة في المضيف. يستخدم النهج الوراثي العكسي لتخليق اللقاح تسلسلات وراثية فيروسية معروفة لإنشاء النمط الظاهري المطلوب: فيروس ذو فاعلية مرضية ضعيفة ومشابه لسلالة الفيروس المنتشرة الحالية. يوفر علم الوراثة العكسية طريقة ملائمة للطريقة التقليدية المتمثلة في إنتاج لقاحات غير نشطة ، الفيروسات التي تم قتلها باستخدام الحرارة أو غيرها من الطرق الكيميائية.

تُعرف اللقاحات التي يتم إنشاؤها من خلال أساليب الوراثة العكسية باسم اللقاحات المخففة ، والتي تحمل اسمًا لأنها تحتوي على فيروسات حية ضعيفة (موهنة). يتم إنتاج اللقاحات المخففة عن طريق الجمع بين الجينات من سلالة فيروس جديدة أو حالية مع فيروسات مخففة من نفس النوع في السابق.^[8]يتم إنشاء الفيروسات المخففة عن طريق نشر فيروس حي تحت ظروف جديدة ، مثل بيضة الدجاج. ينتج عن ذلك سلالة فيروسية لا تزال حية ، ولكنها ليست مسببة للأمراض للإنسان,^[9]نظرًا لأن هذه الفيروسات أصبحت ذات خلل من حيث أنها لا تستطيع تكرار جينومها بشكل كافٍ لنشر مضيف ما وإصابته بالعدوى. ومع ذلك ، لا يزال يتم التعبير عن الجينات الفيروسية في الخلية المضيفة من خلال دورة تكرار واحدة ، مما يسمح بتطوير مناعة.^[10]

لقاح ضد الانفلونزا

هناك طريقة شائعة لإنشاء لقاح باستخدام التقنيات الوراثية العكسية هي استخدام البلازميدات لتوليف الفيروسات المخففة. يتم استخدام هذه التقنية بشكل شائع في الإنتاج السنوي لـ [[لقاح الأنفلونزا] ، حيث يمكن لنظام ثمانية پلازميد إنتاج لقاح فعال بسرعة. يتكون الجينوم الكامل لفيروس الأنفلونزا A من ثمانية شرائح من الحمض النووي الريبي ، وبالتالي فإن الجمع بين ستة بلازميدات فيروسية cDNA مع اثنين من البلازميدات من النوع البري تسمح ببناء سلالة لقاح موهن. من أجل تطوير لقاحات الأنفلونزا ، يتم أخذ شرائح الحمض النووي الريبي الرابعة والسادسة ، التي يتم ترميزها للبروتين هيماگلوتينين و نورامينيداز على التوالي ، من الفيروس المنتشر ، في حين أن الأجزاء الستة الأخرى مستمدة من سيد مخفف سابقًا التواء. يحمل بروتينات HA و NA صنفًا عاليًا مولد مضاد ، وبالتالي يتم أخذها من السلالة الحالية التي يتم إنتاج اللقاح من أجل إنتاج لقاح مطابق بشكل جيد.^[8]

يتم تصنيع تسلسل cDNA من الحمض النووي الريبي الفيروسي من سلالات رئيسة مخففة باستخدام RT-PCR.^[8] يمكن بعد ذلك إدراج هذا cDNA بين محفز پوليميريز RNA I (Pol I) وتسلسل المنهي. بعد ذلك ، يحيط تسلسل cDNA و پول I بدورهما بمحفز مروج پوليميريز II (پول II) وموقع متعدد الأدين.^[11] ثم يتم إدراج هذا التسلسل بأكمله في الپلازميد. يتم نقل ستة پلازميدات مستمدة من سلالة رئيسية مخففة cDNA إلى الخلية المستهدفة ، وغالبا ما تكون بيضة دجاج ، جنبا إلى جنب مع اثنين من الپلازميدات من سلالة الأنفلونزا البرية المنتشرة حاليا. داخل الخلية المستهدفة ، يقوم كل من إنزيم Pol I و Pol II "المكدسين" بنسخ cDNA الفيروسي لتوليف كل من الحمض النووي الريبي الفيروسي السلبي والرنا الإيجابي mRNA ، مما يخلق بشكل فعال فيروس موهن.^[8] والنتيجة هي سلالة لقاح ذات خلل تشبه سلالة الفيروس الحالية ، مما يسمح للمضيف ببناء المناعة. يمكن عندئذٍ استخدام سلالة اللقاح المُصنَّعة هذه ككائن فيروسي لإنتاج مزيد من اللقاحات.

المميزات والعيوب

اللقاحات المهندسة من علم الوراثة العكسية تحمل العديد من المزايا على تصاميم اللقاحات التقليدية. وأبرزها سرعة الإنتاج. بسبب التباين العالي للمستضد في HA و NA گليكوپروتينات ، فإن النهج الوراثي العكسي يسمح بالنمط الوراثي الضروري (أي واحد يحتوي على پروتينات HA و NA مأخوذة من سلالات الفيروس المنتشرة حاليًا) ليتم صياغته بسرعة.^[8] بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن المنتج النهائي من إنتاج لقاح الوراثة العكسية الموهّن هو فيروس حي ، يتم عرض مناعة أعلى من اللقاحات التقليدية المعطلة.,^[12]التي يجب أن تقتل باستخدام الإجراءات الكيميائية قبل نقلها كلقاح. ومع ذلك ، بسبب الطبيعة الحية للفيروسات المخففة ، قد تنشأ مضاعفات في نقص المناعة المرضى.^[13]هناك أيضًا احتمال أن يؤدي حدوث طفرة في الفيروس إلى عودة اللقاح إلى فيروس غير مخفّف حي.^[14]

للاستزادة

Forward genetics

المراجع

^ Egener et al. BMC Plant Biology 2002 2:6 doi:10.1186/1471-2229-2-6
^ Reski R (1998). "Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics". Trends Plant Sci. 3 (6): 209–210. doi:10.1016/S1360-1385(98)01257-6.
^ Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H, Anderson K, Andre B, et al. (August 1999). "Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis". Science. 285 (5429): 901–6. doi:10.1126/science.285.5429.901. PMID 10436161.
^ Schween G, Egener T, Fritzowsky D, Granado J, Guitton MC, Hartmann N, Hohe A, Holtorf H, Lang D, Lucht JM, Reinhard C, Rensing SA, Schlink K, Schulte J, Reski R (May 2005). "Large-scale analysis of 73 329 physcomitrella plants transformed with different gene disruption libraries: production parameters and mutant phenotypes". Plant Biology. 7 (3): 228–37. doi:10.1055/s-2005-837692. PMID 15912442.
^ Manis JP (December 2007). "Knock out, knock in, knock down--genetically manipulated mice and the Nobel Prize". The New England Journal of Medicine. Massachusetts Medical Society. 357 (24): 2426–9. doi:10.1056/NEJMp0707712. OCLC 34945333. PMID 18077807.
^ McClean, Phillip. "Types of Mutations". Genes and Mutations. North Dakota State University. Retrieved April 27, 2015.
^ Lamour, Kurt; Tierney, Melinda. "An Introduction to Reverse Genetic Tools for Investigating Gene Function". APSnet. The American Phytopathological Society.
^ ^أ ^ب ^ت ^ث ^ج Hoffmann, Erich; Krauss, Scott; Perez, Daniel; Webby, Richard; Webster, Robert (2002). "Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines" (PDF). Vaccine. 20 (25–26): 3165–3170. doi:10.1016/s0264-410x(02)00268-2. PMID 12163268 – via Elsevier.
^ Badgett MR, Auer A, Carmichael LE, Parrish CR, Bull JJ (October 2002). "Evolutionary dynamics of viral attenuation". Journal of Virology. 76 (20): 10524–9. doi:10.1128/JVI.76.20.10524-10529.2002. PMC 136581. PMID 12239331.
^ Lauring AS, Jones JO, Andino R (June 2010). "Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines". Nature Biotechnology. 28 (6): 573–9. doi:10.1038/nbt.1635. PMC 2883798. PMID 20531338.
^ Mostafa A, Kanrai P, Petersen H, Ibrahim S, Rautenschlein S, Pleschka S (2015-01-23). "Efficient generation of recombinant influenza A viruses employing a new approach to overcome the genetic instability of HA segments". PLOS ONE. 10 (1): e0116917. doi:10.1371/journal.pone.0116917. PMC 4304806. PMID 25615576.{{cite journal}}: CS1 maint: unflagged free DOI (link)
^ Stobart CC, Moore ML (June 2014). "RNA virus reverse genetics and vaccine design". Viruses. 6 (7): 2531–50. doi:10.3390/v6072531. PMC 4113782. PMID 24967693.{{cite journal}}: CS1 maint: unflagged free DOI (link)
^ "General Recommendations on Immunization". www.cdc.gov (in الإنجليزية). Retrieved 2017-04-01.
^ Shimizu H, Thorley B, Paladin FJ, Brussen KA, Stambos V, Yuen L, Utama A, Tano Y, Arita M, Yoshida H, Yoneyama T, Benegas A, Roesel S, Pallansch M, Kew O, Miyamura T (December 2004). "Circulation of type 1 vaccine-derived poliovirus in the Philippines in 2001". Journal of Virology. 78 (24): 13512–21. doi:10.1128/JVI.78.24.13512-13521.2004. PMC 533948. PMID 15564462.

روابط خارجية

From the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) site:
- Reassortment vs. Reverse Genetics
- Reverse Genetics: Building Flu Vaccines Piece by Piece
From the National Center for Biotechnology Information (NCBI) site:
- Neumann G, Hatta M, Kawaoka Y (2003). "Reverse genetics for the control of avian influenza". Avian Diseases. 47 (3 Suppl): 882–7. doi:10.1637/0005-2086-47.s3.882. PMID 14575081.
- Neumann G, Fujii K, Kino Y, Kawaoka Y (November 2005). "An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46): 16825–9. doi:10.1073/pnas.0505587102. PMC 1283806. PMID 16267134.
- Ozaki H, Govorkova EA, Li C, Xiong X, Webster RG, Webby RJ (February 2004). "Generation of high-yielding influenza A viruses in African green monkey kidney (Vero) cells by reverse genetics". Journal of Virology. 78 (4): 1851–7. doi:10.1128/JVI.78.4.1851-1857.2004. PMC 369478. PMID 14747549.

الكلمات الدالة:

هندسة وراثية

[1] Egener et al. BMC Plant Biology 2002 2:6 doi:10.1186/1471-2229-2-6

[2] Reski R (1998). "Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics". Trends Plant Sci. 3 (6): 209–210. doi:10.1016/S1360-1385(98)01257-6.

[Winzeler1999-3] Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H, Anderson K, Andre B, et al. (August 1999). "Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis". Science. 285 (5429): 901–6. doi:10.1126/science.285.5429.901. PMID 10436161.

[4] Schween G, Egener T, Fritzowsky D, Granado J, Guitton MC, Hartmann N, Hohe A, Holtorf H, Lang D, Lucht JM, Reinhard C, Rensing SA, Schlink K, Schulte J, Reski R (May 2005). "Large-scale analysis of 73 329 physcomitrella plants transformed with different gene disruption libraries: production parameters and mutant phenotypes". Plant Biology. 7 (3): 228–37. doi:10.1055/s-2005-837692. PMID 15912442.

[Manis-5] Manis JP (December 2007). "Knock out, knock in, knock down--genetically manipulated mice and the Nobel Prize". The New England Journal of Medicine. Massachusetts Medical Society. 357 (24): 2426–9. doi:10.1056/NEJMp0707712. OCLC 34945333. PMID 18077807.

[6] McClean, Phillip. "Types of Mutations". Genes and Mutations. North Dakota State University. Retrieved April 27, 2015.

[7] Lamour, Kurt; Tierney, Melinda. "An Introduction to Reverse Genetic Tools for Investigating Gene Function". APSnet. The American Phytopathological Society.

[:0-8] أ ^ب ^ت ^ث ^ج Hoffmann, Erich; Krauss, Scott; Perez, Daniel; Webby, Richard; Webster, Robert (2002). "Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines" (PDF). Vaccine. 20 (25–26): 3165–3170. doi:10.1016/s0264-410x(02)00268-2. PMID 12163268 – via Elsevier.

[9] Badgett MR, Auer A, Carmichael LE, Parrish CR, Bull JJ (October 2002). "Evolutionary dynamics of viral attenuation". Journal of Virology. 76 (20): 10524–9. doi:10.1128/JVI.76.20.10524-10529.2002. PMC 136581. PMID 12239331.

[10] Lauring AS, Jones JO, Andino R (June 2010). "Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines". Nature Biotechnology. 28 (6): 573–9. doi:10.1038/nbt.1635. PMC 2883798. PMID 20531338.

[11] Mostafa A, Kanrai P, Petersen H, Ibrahim S, Rautenschlein S, Pleschka S (2015-01-23). "Efficient generation of recombinant influenza A viruses employing a new approach to overcome the genetic instability of HA segments". PLOS ONE. 10 (1): e0116917. doi:10.1371/journal.pone.0116917. PMC 4304806. PMID 25615576.{{cite journal}}: CS1 maint: unflagged free DOI (link)

[12] Stobart CC, Moore ML (June 2014). "RNA virus reverse genetics and vaccine design". Viruses. 6 (7): 2531–50. doi:10.3390/v6072531. PMC 4113782. PMID 24967693.{{cite journal}}: CS1 maint: unflagged free DOI (link)

[13] "General Recommendations on Immunization". www.cdc.gov (in الإنجليزية). Retrieved 2017-04-01.

[14] Shimizu H, Thorley B, Paladin FJ, Brussen KA, Stambos V, Yuen L, Utama A, Tano Y, Arita M, Yoshida H, Yoneyama T, Benegas A, Roesel S, Pallansch M, Kew O, Miyamura T (December 2004). "Circulation of type 1 vaccine-derived poliovirus in the Philippines in 2001". Journal of Virology. 78 (24): 13512–21. doi:10.1128/JVI.78.24.13512-13521.2004. PMC 533948. PMID 15564462.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]